细胞培养技术简介
细胞培养是指在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，并使之生存和生长。
一、细胞培养技术应用于生物医学研究的优点
1．由于人工培养条件易于改变并能严格控制和进行单因素分析，所以便于用各种物理的、化学的或生物的外界因素来研究细胞生命活动的规律；
2．由于细胞处于体外环境中，便于用各种技术方法研究和观察细胞的结构和功能的变化；
3．由于细胞在体外环境中可以长期存活和传代，因而便于研究和观察细胞遗传性的变化；
4．可以比较经济地、大量地提供生物性状相同的细胞作为研究对象。
细胞培养作为一种研究技术也有其局限性，主要是细胞离体以后失去与其周围环境的密切联系，其细胞生物学性质必然会发生某些改变，这是应用细胞培养技术时应该充分注意的问题。
二、体外培养细胞的生存条件
1．营养物质
能进入细胞被细胞利用和参与细胞代谢活动的物质称为营养物质。体外培养细胞所需的营养物质与体内细胞相同，主要有下列三大类。
(1)糖
培养细胞有氧氧化和无氧酵解的强度都很大。六碳糖是主要的能源。
(2)氨基酸
氨基酸是细胞用以合成蛋白质的原料。
(3)维生素
维生素是细胞生长的必须营养物质。
此外，一些离子和微量元素也是细胞生长所需要的，可以从血清中得到补充。
2．环境
(1)无菌环境
防止污染是保证培养细胞生存的主要条件。在培养环境中不得有细菌、病毒、支原体、真菌或其它微生物，所以操作中要努力做到最大限度的无菌。
(2)温度
适宜的温度是保证细胞在体外生存的基本条件之一，人和哺乳动物细胞最适宜的培养温度为35~37°C。
(3)气体
气体也是细胞生存的必需条件之一，所需的气体主要有O2和CO2。O2参与细胞有氧氧化。CO2既是细胞代谢产物，也是细胞所需成分，主要与维持培养液酸碱度有直接关系。
(4)酸碱度
多数细胞的适宜pH为7.2~7.4，偏离此范围对细胞可产生有害影响。
(5)渗透压
大多数细胞对渗透压有一定的耐受能力，在260~320mOsm/kg范围内都适宜。
3．废物的排出
体内组织、细胞产生的废物的排出依赖精密的排泄系统，而体外培养的细胞则靠换掖排出废物和代谢产物，故适时的换掖对体外培养细胞极为重要。
三、培养细胞的生长与增殖
大多数二倍体细胞在培养过程中维持有限的生存期，最多生存1年左右，传30~50代，相当于150~300个细胞周期。在全生存过程中，大致经历以下三个阶段：
1．原代培养期
从体内取出组织接种培养到第一次传代的阶段，一般持续1~4周。次期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。
2．传代期
在全生命期中持续时间最长，在培养条件好的情况下，细胞增殖旺盛，并维持二倍体核型。为保持二倍体细胞性质，细胞应在原代培养或传代后早期冻存。
3．衰退期
细胞仍生存，但不增殖或增殖很慢，最后衰退死亡。
四、细胞系与细胞株
1．细胞系
原代培养物经首次传代成功即成细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系组成。
2．细胞株
通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志的培养物称为细胞株。细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。
原代细胞培养——组织块贴壁培养法
一、实验目的
1．了解组织块贴壁培养法的原理和方法。
2．培养无菌操作的习惯。
二、实验原理
动物机体或组织从机体中取出剪成碎块后，移入适当的器皿内，若给予所需营养(培养基)、pH、温度等条件，组织块内的细胞能移出组织块贴壁生长并繁殖。
三、器材、试剂和材料
1．器材
解剖剪、解剖镊、眼科剪、眼科镊、培养瓶、各种吸管、酒精灯、倒置显微镜、无菌衣、帽、口罩等。
2．试剂
PBS缓冲液、RPMI 1640培养液、7.4%NaHCO3、青链霉素抗菌素液、小牛血清等。
3．材料
乳鼠肝脏
四、操作步骤
1．处死
取新生3~5天乳鼠一只，用颈椎脱臼法处死（一手捏住鼠头、颈连接处，一手捏住鼠尾，分别向两端用力牵拉，直到拉死为止）。将整只乳鼠浸于盛有75%酒精的烧杯中，3~5秒后，取出置于消毒的培养皿中，带入无菌室。
2．取材
(1)分别用碘洒和酒精消毒乳鼠胸部和腹部。
(2)用眼科剪刀由腹部(肛门前1~2cm)朝颈部将皮肤剪开，用两把止血钳将皮肤拉向两侧暴露皮下组织，再次用碘酒和酒精消毒皮下组织。
(3)换一把剪刀剪开腹肌，打开腹腔，暴露出肝脏，剪取一块肝组织（2~3cm3）置于无菌平皿中。
3．制备组织块
(1)用PBS液将肝组织块冲洗1~3次后放入另一个无菌平皿中。
(2)用吸管吸取0.5ml左右培养液置肝组织上，再用弯头眼科剪将肝组织剪成1cm3左右的小块。
4．种植
(3) 用吸管将剪好的组织块吸入，放置于小号培养瓶底部，并使其均匀分布，组织块间距为0.5cm左右。
(2)另用一根吸管吸取适量培养液沿培养瓶颈部瓶壁轻轻加入，以保持组织块湿润即可，千万不要淹没组织块。
(3)轻轻翻转培养瓶使瓶底朝上，将培养瓶盖好，置37°C CO2培养箱孵育2~3小时，待组织块贴附于瓶底，再将培养瓶翻正继续培养。
5．观察
24小时后在倒置显微镜下观察，若见少量细胞从组织决中游离贴壁，可补加培养基，48小时后即可见大量透明度较高的新生细胞以组织块为中也呈放射状排列。
附：试剂配制
1．PBS
NaCl 8.00g
KCl 0.20g
Na2HPO412H2O 2.89g
NaH2PO4 0.20g
双蒸水 950ml
用1N HCl或7.4%NaHCO3调节pH至7.2~7.4，最后加双蒸水定容至1000ml，15磅30分钟湿热消毒灭菌，4C保存备用。
2．7.4%NaHCO3液
NaHCO3 7.4g
三蒸水至 100ml
溶解后过滤除菌，分装，4C保存。
3．青、链霉素双抗液
将80万U/瓶的青霉素溶于4ml灭菌蒸馏水中，在1000ml的培养基中加入0.5ml；将100万U/瓶链霉素溶于5ml灭菌蒸馏水中，在1000ml的培养基中加入0.5ml。
4．培养基
将培养基溶于总量1/3的双蒸水中，搅拌溶解，加入青、链霉素使其最终浓度为100U/ml。调整pH值至7.2。加入三蒸水定容，过滤除菌。
原代细胞的培养
——原代单层静置培养法
一、实验目的
1．了解原代单层静置培养法的原理和方法。
2．掌握体外培养细胞的基本形态特征。
二、实验原理
动物机体的各种组织或器官从机体中取出，经处理分散成单个细胞，将一定数量的单个细胞置合适的培养容器中，再给予所需的营养(培养基)，pH(7.2~7.4)，温度等适宜的条件，分散的细胞能生存、生长和继续繁殖。
三、 器材、试剂和材料
1．器材
解剖剪、解剖镊、眼科剪、眼科镊、培养皿、玻璃漏斗、三角烧瓶、培养瓶、吸管、纱布等。上述器材均经彻底清洗、烤于、包装并灭菌消毒待用。倒置显微镜、水浴锅、血球计数板、血球计数器、CO2孵箱、试管架、无菌衣、帽、口罩等。
2．试剂
PBS缓冲液、RPMI1640培养液、青链霉素液、7.4%NaHCO3、小牛血清、0.25%胰酶。
3．材料
乳鼠肝脏
四、操作步骤
1．处死
取新生3~5天乳鼠一只，用颈椎脱臼法处死（一手捏住鼠头、颈连接处，一手捏住鼠尾，分别向两端用力牵拉，直到拉死为止）。将整只乳鼠浸于盛有75%酒精的烧杯中，3~5秒后，取出置于消毒的培养皿中，带入无菌室。
2．取材
(1)分别用碘洒和酒精消毒乳鼠胸部和腹部。
(2)用眼科剪刀由腹部(肛门前1~2cm)朝颈部将皮肤剪开，用两把止血钳将皮肤拉向两侧暴露皮下组织，再次用碘酒和酒精消毒皮下组织。
(3)换一把剪刀剪开腹肌，打开腹腔，暴露出肝脏，剪取一块肝组织（2~3cm3）置于无菌平皿中。
3．制备组织块
(1)用PBS液将肝组织块冲洗1~3次后放入另一个无菌平皿中。
(2)用吸管吸取0.5ml左右培养液置肝组织上，再用弯头眼科剪将肝组织剪成1cm3左右的小块，用PBS洗至组织发白为止。
4．胰酶消化
用吸管将上述组织块移入消毒的青霉素瓶内，加入5~6倍量的0.25%胰蛋白酶液，置37°C水浴锅内消化30分钟左右，每隔10分钟摇动一次，待组织块变得较疏松、颜色略变白为止。
5．终止消化
弃去胰酶，PBS洗涤2~3次，加入1~2ml无血清培养基，用10 ml大口吸管反复轻轻吹打，使大部分组织块分散成细胞悬液。
6．制备单细胞悬液
(1)过滤收集法；将细胞悬液经放有4~8层纱布的玻璃漏斗过滤入一消毒三角烧瓶内。
(2)离心收集法：将细胞悬液静置片刻，然后移入消毒离心管中，盖好瓶盖，1000转/分离心5分钟，弃上清，加入PBS冲洗细胞团块，再次离心，弃上清，加入培养基制成单细胞悬液。
7．细胞计数
从收集到的细胞悬液中取出少许，用血球计数板按白细胞计数法进行计数。计数后用培养基稀释至50万/m1个细胞，并补足细胞悬液中的小牛血清和青链霉素(小牛血清占10~20%，青链霉素100u/ml)。
8．分装
将上述细胞悬液分装入培养瓶内(小培养瓶2~3m1/瓶，大培养瓶5ml/瓶)
9．孵育
将瓶内细胞悬液摇均匀，瓶盖拧松，并用酒精棉球擦拭后置CO2孵箱内孵育。
10．观察
24小时后观察细胞贴壁情况，以后应每天观察细胞。
附：试剂配制
0.25%胰酶
称取一定量的胰蛋白酶，按0.25%的浓度加入三蒸水，并调pH值至7.2左右，然后在超净工作台内用注射滤器进行消毒除菌，分装入瓶，低温冰箱保存。
细胞的复苏
一、 实验目的
学习细胞复苏的方法步骤，领会细胞复苏过程中的要领。
二、 实验原理
冻存了一定时间的细胞，被取出融解，重新再接种恢复其活力的过程,即为复苏。由于快速融化冻存细胞，能避免水分渗入细胞内形成再结晶，故复苏时，应该尽量使细胞在短时间内融化
三、器材与试剂
1．器材
搪瓷罐、夹钳、吸管、离心管、培养瓶、酒精灯、酒精绵球、CO2培养箱、超净工作台
2．试剂
培养液(配制方法同原代法养)
四、操作步骤
1．从液氮中取出装有细胞的冻存管，投入盛有37°C温水的搪瓷罐中，不停摇晃，令其尽快融化。
2．在超净工作台上用酒精绵球擦拭冻存管，打开冻存管盖，吸出细胞悬液，注入离心管中，滴加10倍以上培养液，混匀、离心、弃上清液。
3．用新培养液适当稀释离心管中细胞，制成悬液，按1~10×105密度，接种细胞于培养瓶中，放于37°C CO2孵箱中静置培养。
细胞的传代
一、实验目的
1．学习传代细胞培养的原理及一般方法。
2．掌握传代各步骤的操作。
二、实验原理
培养的细胞通过增殖达到一定数量后，为了避免因为生存空间不足或密度过大造成的营养障碍，需要进行及时的分离、稀释，此过程即为传代。使贴壁生长细胞脱离生长表面，并且分散，这一过程称为消化。0.25%胰酶，0.02%EDTA液为常用的消化液。
三、器材和试剂
1．器材
吸管、培养瓶、离心管、计数板、倒置显微镜。
2．试剂
PBS、培养液、0.25%胰酶液。
3．材料
培养细胞
四、操作步骤
l．贴壁细胞的传代培养
(1)弃去原培养瓶中的旧培养液。
(2)加入适量的PBS，轻轻摇动，清洗残留的培养液，将PBS弃掉。
(3)加入适量的消化液，使其覆盖整个细胞培养面，摇动培养瓶，将培养瓶放在倒置显微镜下观察，当细胞胞质回缩，胞间间隙增大后，吸出消化液。
(4)向培养瓶中加入PBS，轻轻转动培养瓶，将PBS弃掉，再加入培养液终止消化。
(5)用吸管吸取培养瓶中的培养液，反复吹打瓶壁制备细胞悬液，吹打时不能用力过猛，以免损伤细胞，尽量避免出现气泡。
(6)接种：对上述细胞计数，按照1×105~106接种细胞于培养瓶中。
2．悬浮细胞的传代
(1) 将细胞连同培养液一并转移到离心管中。
(2) 离心800~1000rpm，5min，弃上清液。
(3) 加入新的培养液到离心管中，吸管吹打、制备悬液。
(4) 将悬液接种于培养瓶中。
细胞的冻存
一、实验目的
学习细胞冻存的方法、步骤。
二、实验原理
体外培养的细胞，随着传代次数的增加，其各种生物特性会逐渐发生变化，为此，需要将培养的细胞及时加以冻存。直接冻存细胞会导致其内外环境形成冰晶，从而使细胞内部发生一系列变化，如机械损伤、电解质升高、蛋白质变性等，进而可导致细胞死亡。因此，在冻存细胞时，常向培养液中加入适量的甘油或DMSO，从而使冰点下降，通过缓慢冷冻，避免或减少冰晶的形成。
三、器材和试剂
1．器材
吸管、离心管、l ml冻存管、离心机。
2．试剂
0.25%胰酶、培养液、冻存液。
四、操作步骤
1．0.25%胰酶消化处于对数生长期的单层细胞。
2．依照传代的方法把消化好的细胞收集于离心管中，计数后离心。
3．弃去离心后的上清液，加入冻存培养液使得冻存液中的细胞密度达到5×106~1×107/ml。
4．用吸管吹打细胞制悬，分装入冻存管中。
5．冻存的过程如下：
-4°C，1h®-20°C，2h®-85°C，1-2h®液氮
附：试剂配制
细胞冻存液
培养基（含10%小牛血清） 9份
二甲基亚砜（DMSO） 1份
培养细胞的观察
一、实验目的
1．掌握培养细胞的观察方法。
2．了解体外培养细胞的形态和生长过程。
二、实验原理
体外培养的细胞，无论是上皮样的还是成纤维样的，只要是属于单层培养方式，其生长过程可人为地划分成五个时期：游离期、吸附期、繁殖期、维持期和衰退期。细胞在繁殖期开始生长，按照惯例细胞生长到+++ ~ ++++时即可传代。
三、材料和试剂
1．材料
原代培养培养物、传代培养培养物。
2．试剂
7.4%NaHCO3溶液。
3．器材
CO2孵箱、倒置显微镜。
四、操作步骤
1．培养液的观察
细胞培养12~24小时后即可观察。从CO2孵箱中取出培养瓶，拧紧瓶盖后观察培养基的颜色和透明度的变化。培养基颜色由桃红—颜色变浅—橙黄—淡黄，说明细胞代谢产生酸性产物使培养基pH（正常为pH7.2~7.4）下降，如果培养基颜色不变，说明细胞胞生长状态不好或已死亡。培养基由透明—混浊时就应考虑是否被细菌污染。
2．细胞生长情况的观察
将培养瓶放在倒置显微镜载物台上，打开光源开关后，调节载物台高度进行对焦(用10×物镜即可)，观察下列指标：
(1)细胞轮廓
轮廓清晰、界限清楚说明细胞生长良好。
(2)细胞形状
典型上皮样细胞为多边形，也可为短棱形、扇形等不规则细胞，呈镶嵌状排列。成纤维细胞一般为菱形，三角形或长条形，呈网状排列，细胞致密时呈放射状排列。
(3)细胞透明度
主要看细胞内颗粒多少，颗粒较多透明度差时，表明细胞生长较差。
繁殖情况可用+表示：
+：细胞占瓶壁有效面积25%以内。
++：细胞占瓶壁有效面积25%-75%。
+++：细胞占瓶壁有效面积75%-95%，细胞排列致密.仍有空隙。
++++：细胞占瓶壁有效面积95%以上，成为致密单层。
细胞生长从++~++++为指数生长期，+++以上即可传代。
细胞悬液中细胞数目的计数
一、实验目的
1．学习细胞悬液中细胞数目的计数方法。
2．学会使用血球计数板。
二、器材、试剂和材料
1．器材
CO2孵箱、普通光学显微镜、血球计数板
2．试剂
PBS、0.25%胰酶、培养基
3．材料
培养细胞
三、操作步骤
1．细胞悬液的制备
取传代培养细胞一瓶，先用PBS洗涤一次，再用0.25%的胰酶消化，在倒置显微镜下观察，待细胞由致密单层变得间隙稀疏时，弃去胰酶液，加入2~3ml培养液终止消化，将细胞从瓶壁上吹下并分散均匀，即细胞悬液。
2．细胞计数方法
细胞计数一般使用血球计数板，采用白细胞计数法进行。方法如下：
(1)取一付血球计数板，将盖破片盖在血球计数板的槽上。
(2)用吸管{或滴管)将待测细胞悬液吹打均匀，吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，以盖片下充满悬液为度。注意盖片下不应有气泡。也不应让悬液流入旁边糟中，否则计数不准确。
(3)将血球汁数板放在显微镜的低倍镜下，调节焦距，待镜中出现网格线后，数出四角四个大格（每一大格含16个中格)中的细胞数目。
数细胞的原则是：只计数完整的细胞。若细胞聚集成团时只按一个细胞计数，如果细胞压在格线上时，则计上线不计下线，计右线不计左线上的细胞。
(4)按下列公式计算：
四大格的细胞总数
细胞悬液的细胞数/ml= ×稀释倍数(N)×10.000
4
为了减少误差，每种样品至少重复计数2~3次，取平均值。
公式中除以4是由于计数了四个大格的细胞数。乘N是由于细胞悬液稀释了N倍。乘10.000是因为计数板中每一大格的体积为1.0m(长)×1.0m(宽)×0.1m(高)=0.1mm3，所以一大格的细胞数×10.000=细胞数/ml。
细胞活力的检测
一、实验目的
了解培养细胞活力的检测方法
二、实验原理
细胞受损或死亡后，细胞膜的通透性发生改变，某些染料可穿透变性的细胞膜与细胞内DNA结合而使细胞核着色。活细胞可以阻止这类染抖进入细胞而拒染。因此，借助于某些染料即可鉴别死细胞与活细胞。这种方法称为染料排除法。最常用的是台盼兰，此外还有伊红Y和苯胺黑等。
三、器材、试剂及材料
1．器材
血球计数板、血球计数器、试管、吸管、试管架、光学显微镜。
2．试剂
0.4%台盼兰染液、0.25%胰酶、PBS液。
3．材料
各种培养细胞。
三、操作步骤
台盼兰检测细胞活力是最方便、最常用的检测方法，过程如下：
1．用胰酶消化法制备单个细胞悬液（细胞浓度106/ml为宜）。
2．染色：取9滴细胞悬液于试管中，加1滴0.4%台盼兰，摇匀。
3．计数：用血球计数板在3分钟内（超过3分钟细胞不再拒染）分别计数活细胞（未染色者）和死细胞（染色者）。
4．计数活细胞率：按下列公式计算。
活细胞总数
活细胞率（%）= ×100%
活细胞总数+死细胞总数
附：试剂配制
0.4%台盼蓝染液：称取台盼蓝0.4克置研钵中，加入几滴三蒸水研磨，溶于100ml三蒸水中，滤纸过滤备用。
活细胞的观察
——小白鼠精子形态观察和活力测定
一．实验目的
观察小白鼠精子的形态。
二、器材、试剂及材料
1．器材
显微镜、平皿、解剖剪、解剖镊、牙签、滴管、盖玻片、载玻片
2．试剂
生理盐水
3．材料
雄性小白鼠
三、实验步骤
1．处死
取一雄性小白鼠，颈椎脱臼法处死（一手捏住鼠头、颈连接处，一手捏住鼠尾，分别向两端用力牵拉，直到拉死为止）。
2．取材
取出睾丸，放入盛有1—2ml生理盐水的培养皿中，用剪刀剪开睾丸曲精细管，再用牙签在培养皿的生理盐水中充分搅拌，使精子游离出来，制成精子悬液。
3．滴片
吸一滴精子悬液于洁净的载玻片上，加上盖玻片，镜下观察。
四、结果观察
1．形态观察
镜下可见许多活动的精子，它们形如蝌蚪，由头部、中段和尾丝三部分构成，能运动。
2．活力测定
精子活力：精子活力包括两层含义，一为正常活动精子的数目，也就是精子活动百分率，二为正常活动精子的质量，即精子活动能力。前者为活精子的定量测定，也就是测定活精子和死精子的比例。后者是活精子的定性测定，也就是测定精子的活动能力。根据精子向前游动的能力，分为（a）、（b）、（c）、（d）4个精子。
（a） 精子活动能力很好，具有快速呈直线向前运动。
（b） 精子活动良好，呈慢速或迟钝的直线或非直线向前运动。
（c） 精子活动能力差，不能向前运动，只在原处移动或旋转移动。
（d） 精子无活动能力，即不活动的精子。
附：试剂配制
生理盐水
氯化钠 0.9g
蒸馏水 100ml
活细胞与死细胞的鉴别
——小白鼠活精子与死精子的鉴别
一、实验目的
掌握活细胞与死细胞的鉴别方法
二、器材、试剂及材料
1．器材
显微镜、平皿、解剖剪、解剖镊、牙签、滴管、盖玻片、载玻片。
2．试剂
生理盐水、0.5%伊红。
3．材料
雄性小白鼠
二、实验原理
细胞死亡或受损后，细胞膜的通透性发生改变，某些染料可穿透变性的细胞膜与细胞内组分结合使细胞着色。活细胞可以阻止这类染料进入细胞而拒染，活精子的胞浆完整无损，不易让染料透过而不能被着色，死精子的胞浆膜受损，可以让染料透过而被染上颜色，这样，借助于某些染料即可鉴别活精子细胞与死精子细胞。
三、 实验步骤
1．处死
取一雄性小白鼠，颈椎脱臼法处死（一手捏住鼠头、颈连接处，一手捏住鼠尾，分别向两端用力牵拉，直到拉死为止）。
2．取材
取出睾丸，放入盛有1—2ml生理盐水的培养皿中，用剪刀剪开睾丸曲精细管，再用牙签在培养皿的生理盐水中充分搅拌，使精子游离出来，制成精子悬液。
3．染色
取1滴（10--15ml）新鲜混匀的精液与1滴0.5%伊红溶液于载玻片上，混匀后覆于盖玻片，待1--2分钟后在镜下观察（高倍镜）。
四、结果观察
镜下活精子（在普通显微镜下未着色）与死精子（着红色）。随机计数100个精子，计算活精子百分率。
附：试剂配制
0.5%伊红
伊红 0.5g
蒸馏水 100ml
线粒体的活体染色与观察
一、实验目的
了解线粒体的活体染色方法。
二、器材、试剂及材料
1．器材
显微镜、载玻片、盖玻片、滴管、吸水纸、小镊子、解剖器具
2．试剂
林格氏液、1%詹纳斯绿染液、1/5000詹纳斯绿染液
3．材料
口腔粘液上皮细胞
三、实验原理
活体染色是利用某些无毒或毒性较小染色剂显示出细胞内某些天然构造存在的真实性，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以至引起细胞的死亡的一种染色方法。活体染色主要是由于染料的堆积，即染料的胶粒固定，堆积在细胞内某种特殊的构造里面，这种堆积主要是受染料分子的电荷的影响。活体染料多为碱性染料，它们的胶粒表面带有阳离子，可与带有阴离子的细胞内部结果发生电吸引作用，从而引起染料的堆积。活体染色具有专一性，其中，詹纳斯绿B可与线粒体发生颜色反应，高尔基复合体能与硝酸银发生颜色反应等，而细胞质和细胞核在活体染色过程中不被着色。因此，根据细胞器的着色情况，可了解细胞器的形态及分布情况。
四、 实验步骤
1．取材
用牙签刮下口腔粘膜上皮细胞涂于清洁的载波片上。
2．染色
滴加1%詹纳斯绿染液在室温下染色10分钟。
3．盖片
盖上盖玻片，盖玻片下两侧可放头发丝支撑，使细胞不被挤压。
五、结果观察
在高倍镜下，可见线粒体被染成亮绿色，细胞质接近无色。
附：试剂配制
1．林格（Ringer）试剂
氯化钠 8.05g（变温动物6.5g）
氯化钾 0.42g
氯化钙 0.18g
双蒸水 100ml
2．詹纳斯绿B溶液
称取0.5g詹纳斯绿B溶液于50ml林格氏溶液中，稍加热（30~40°C），使之快速溶解。用滤纸过滤后，即为1%原液，装入棕色瓶备用。为了保持其充分的氧化能力，最好是临用前配制。
临用前取1%原液1ml加入49ml林格氏溶液中，即成1/5000染色液，装入棕色瓶备用。
细胞核的分离与鉴定
一、 实验目的
1．了解分离细胞核的原理。
2．熟悉离心机和匀浆器的使用方法。
3．掌握细胞核的分离过程。
4．掌握细胞核的鉴定方法。
二、器材、试剂及材料
1．器材
显微镜、普通离心机、天平、离心管、滴管、玻璃漏斗、量筒、25毫升烧杯、解剖剪、镊子、冲洗瓶、纱布、匀浆器、载玻片、盖玻片、染色盘架。
2．试剂
生理盐水、0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化钙溶液、1%甲苯胺兰染液
3．材料
小白鼠肝脏
三、实验原理
细胞核的比重和大小与细胞内其它组分不同，在同一离心场内其沉降速度也不同，所以，可以利用不同转速产生不同离心力（差速离心）将细胞核分离出来。
分离细胞核最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，然后进一步分析鉴定，其基本过程包括组织匀浆、分级分离和分析三个步骤。这种方法已经成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及功能的主要手段。
匀浆指低温下，将组织块放入匀浆器，加入等渗匀浆介质进行破碎细胞，使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。
分析指分离得到的组分，可用细胞化学和生物化学方法进行形态功能鉴定。本实验用甲苯胺兰染细胞核。
五、 实验步骤
1．处死
断头处死小白鼠，手提尾部使腹内血液尽量流出，迅速开腹取肝，在盛有生理盐水的小烧杯中反复洗涤。
2．取材
称取湿重约1g的肝组织放在烧杯中，加入8ml预冷的0.25mol/l蔗糖-0.003mol/l氯化钙溶液，尽量剪碎肝组织。
3．匀浆
将剪碎的肝组织倒入玻璃匀浆器，使匀浆器下端浸入盛有冰块的器皿（如冰盘）。左手握持匀浆器，右手将匀浆捣杆垂直插入管中，上下转动10次，用8层纱布（先用少量蔗糖液润湿纱布）过滤匀浆液于离心管中。
4．离心
在天平上平衡每对离心管，2500rpm离心15分钟，将上清液移入
另一离心管中并涂片①。剩下1ml上清液吹打沉淀成悬液涂片②做好标记，自然干燥。
5．染色
分别在涂片①②上滴加甲苯胺兰染液，染色5-7分钟。
6．洗涤
冲去染液立刻镜下观察。
五、结果观察
高倍镜下可见肝细胞核已游离出来，被染成蓝紫色，圆形，中央有2-4甚至更多个深蓝色的核仁。
附：试剂配制
1．0.25mmol/l蔗糖—0.003mol/l氯化钙溶液
蔗糖 85.5克
氯化钙 0.33克
蒸馏水 100ml
2．1%甲苯胺兰染液
甲苯胺兰 1克
蒸馏水 100ml
细胞骨架的显示与观察
一、实验目的
初步掌握组织化学法显示微丝为主的细胞骨架纤维的基本原理和步骤。
二、器材、试剂和材料
1．器材
CO2培养箱、超净工作台
2．试剂
磷酸缓冲液(PBS)、M-缓冲液、1%TritonX-l00溶液、3%戊二醛液、0.2%考马斯亮蓝R250染液
3．材料
成纤维细胞、Hela细胞
三、实验原理
当成纤维细胞用l%浓度的TritonX-100溶液处理，质膜结构中及细胞内多种蛋白质能被溶解而细胞骨架系统的蛋白质却不会被破坏，经固定和考马斯亮蓝R250染色后，可使细胞骨架蛋白着色，而细胞质背景着色弱，有利细胞骨架纤维显示。
四、实验步骤
1．洗涤
取出载有单层细胞的盖玻片，放在小培养皿中，用PBS洗涤3次。
2．Triton-1000处理
用吸管吸去PBS，用1%TritonX-100溶液处理盖片15~20分钟，以去掉骨架以外的部分蛋白质。
3．洗涤
用吸管吸去TritonX-100溶液，立即用M缓冲液冲洗3次，每次3~5分钟，使细胞骨架系统稳定。
4．固定
用3%戊二醛固定10~20分钟。
5．洗涤
用PBS冲洗标本数次。
6．染色
细胞面向上将盖玻片平放于染色盘架的载玻片上，滴加0.2%考马斯亮蓝R250染色10分钟。
7．洗涤
用蒸馏水冲洗标本，空气干燥，光镜下进行观察。需长时间保存时，可用二甲苯透明，树脂封固。
五、结果观察
在光镜下，可见一些充分伸展的成纤维细胞，细胞呈多角形，其中细胞核被染成蓝色，核内有2、3个不等深蓝色小点为核仁。在细胞质中分布着许多被染成深蓝色的纤维，这些是由许多微丝集聚成的最大的微丝束，也称张力纤维。纤维大多沿细胞长轴方向和细胞突起部分分布。在有些多角形的细胞中，可见一束束纤维沿不同方向交叉分布，有的则交叉成网状结构。
附：试剂配制：
1.磷酸缓冲液（PBS） pH7.2
氯化钠 8.0g
氯化钾 0.2g
磷酸氢二钠 1.15g
磷酸二氢钾 0.2g
蒸馏水 1000ml
2．M-缓冲液 pH7.2
米唑（50mM） 3.404g
氯化钾（50mM） 3.7g
氯化镁(MgCl2.6H20)(0.5M) 101.65mg
EGTA(乙二醇双(2-氨基乙基)醚四乙酸)(lmM) 330.35mg
巯基乙醇(lmM) 0.07ml
甘油(4M) 292ml
蒸饱水加至 1000ml
用1MHCl调节pH至7.20。
3．l%TritonX-100液
TrittonX-l00(聚乙二醇辛基苯基醚) 1ml
M-缓冲液 99ml
4．2%戊二醛液
戊二醛25% 3ml
PBS(pH7.2) 97ml
5. 0.2%考马斯亮兰R250染液
考马斯亮兰R250 0.28g
甲醇 46.5ml
冰醋酸 7ml
蒸馏水 46.5ml
糖原和多糖的显示
一、实验目的
了解糖原和多糖的呈色反应的原理和方法。
二、器材、试剂及材料
1．器材
显微镜、解剖盘、解剖镊、解剖剪、染色盘架、染色缸、载玻片、吸管、吸水纸
2．试剂
Carnoy固定液、0.5%高碘酸水溶液、Schiff氏液、2%甲基绿染液
3．材料
小白鼠肝脏
三、实验原理
含乙二醇基的糖类在高碘酸的作用下氧化而产生双醛基，醛基进而与Schiff氏液反应，使无色品红变成紫色染料而附着于糖类的组织上。
四、实验步骤
1．取材
小白鼠新鲜肝脏
2．固定
Carnoy固定液作用2小时
3．切片
常规石蜡切片后脱蜡（以上步骤由教师完成）
4．反应
0.5%高碘酸水溶液处理5分钟
5．洗涤
蒸馏水速洗
6．染色
Schiff氏液染色30~60分钟
7．洗涤
自来水冲洗5~10分钟，蒸馏水稍冲
8．复染
2%甲基绿复染30秒钟，蒸馏水速洗，吸干
五、结果观察
PAS阳性反应物呈红色，颗粒或团状，分布于细胞质中，红色的深度反应含糖量的多少。
附：试剂配制
1．2%甲基绿染液
去杂质甲基绿粉 2.2g
0.2mol/L醋酸缓冲液 100ml（pH4.8）
甲基绿粉往往混有甲基紫，会影响染色效果，需预先除去。方法如下：甲基绿粉溶于蒸馏水，置分液漏斗中，加入足量氯仿用力振荡，然后静置，除去含甲基紫的氯仿。再重新加入氯仿，如此反复数次直至氯仿中不再有紫色为止，最后放40℃温箱中干燥备用。
2．Schiff氏液
1g碱性品红溶于200ml沸水，冷却至60℃时过滤，滤后加1N盐酸20ml、亚硫酸氢钠2g塞紧瓶口过夜。次日加300mg活性碳，振荡摇匀。过滤后溶液应无色透明，塞紧瓶口，存于暗冷处。溶液变红则失效。
3．Carnoy固定液
乙醇 60ml
氯仿 30ml
冰醋酸 10ml（用前现配）
4．0.5%高碘酸水溶液
高碘酸 0.5g
蒸馏水 100ml
细胞内过氧化物酶的显示
一、实验目的
1．了解过氧化物酶呈色反应的原理和方法
2．熟悉过氧化物酶在细胞内的分布情况
二、器材、试剂及材料
1．器材
显微镜、解剖盘、解剖镊、解剖剪、染色盘架、染色缸、载玻片、吸管、吸水纸
2．试剂
0.5%硫酸铜溶液、联苯胺混合液、1%番红染液
3．材料
小白鼠
三、实验原理
过氧化物酶体系能把许多胺类氧化物氧化成有色化合物。用联苯胺混合液处理标本，细胞内的过氧化物酶能把联苯胺氧化成蓝色或棕色的产物（蓝色为中间产物—联苯胺蓝，不稳定，可自然转变为棕色—联苯胺棕），由此可显示细胞中过氧化物酶的存在与分布。
四、实验步骤
1．处死
颈椎脱臼法处死小白鼠，打开胸腔，剪破心脏，制成血涂片，晾干。
2．固定
0.5%硫酸铜固定1分钟
3．反应
联苯胺混合液处理3~5分钟
4．洗涤
流水冲洗
5．染色
1%番红染色1分钟，水洗，晾干
五、结果观察
显微镜下可见视野中有大量红细胞，混杂在红细胞中的巨噬细胞内可见蓝色或棕色颗粒，即为过氧化物酶存在部位。
附：试剂配制
1．0.5%硫酸铜溶液
硫酸铜 0.5g
蒸馏水 100ml
2．联苯胺混合液
联苯胺 0.2g
蒸馏水 100ml
3% H2O2（H2O21.5ml加蒸馏水至50ml） 2滴
酸性磷酸酶的显示
一、实验目的
1．了解酸性磷酸酶呈色反应的一般原理和方法
2．熟悉酸性磷酸酶在细胞内的分布情况
二、器材、试剂及材料
1．器材
显微镜、吸水纸
2．试剂
孵育液、1%硫化铵溶液、1%番红染液
3．材料
小白鼠肝组织冰冻切片或石蜡切片（脱蜡）
三、实验原理
用b-甘油磷酸钠作为底物，在pH 5的酸性环境下，酸性磷酸酶在镁离子激活下使甘油磷酸钠分解，释放出磷酸根。加入硝酸铅，继而加入硫化铵就生成棕黑色的硫化铅在原位沉淀下来。
四、实验步骤
1．切片
小白鼠肝组织冰冻切片或石蜡切片（脱蜡）。切片若经福尔马林固定需流水冲洗5分钟后晾干
2．孵育
浸入孵育液，37℃保温2小时
3．洗涤
蒸馏水洗数次
4．反应
1%硫化铵浸3分钟
5．染色
流水冲洗后用番红复染5分钟
6．洗涤
流水冲洗、晾干、镜检
五、结果观察
有酶活性处出现棕色沉淀
附：试剂配制
1．1%番红染液
1． 番红染粉 1.0g
2． 蒸馏水 100ml
2．1%硫化铵溶液
3． 硫化铵 1ml
4． 蒸馏水至 100ml
5．孵育液
醋酸缓冲液(pH7.4) 12ml
5%pb(NO3)2 2ml
3.2%b-甘油磷酸钠 4ml
蒸馏水 74ml
细胞内酸性蛋白和碱性蛋白的显示
一、 实验目的
1．了解酸性蛋白和碱性蛋白呈色反应的一般原理和方法
2．熟悉酸性蛋白和碱性蛋白在细胞内的分布情况
二、器材、试剂及材料
1．器材
显微镜、解剖盘、解剖镊、解剖剪、染色盘架、染色缸、载玻片、吸管、吸水纸。
2．试剂
95%乙醇、5%三氯醋酸、0.1%酸性固绿染液、0.1%碱性固绿染液。
3．材料
蟾蜍
三、实验原理
由于不同蛋白质分子中所带碱性基团和酸性基团的数量不同，在不同的pH溶液中整个蛋白质所带电荷的多少也不同。在某一生理条件下，整个蛋白质带负电荷多则为酸性蛋白；带正电荷多则为缄性蛋白。因此，可将标本经三氯醋酸处理，抽提核酸后，用不同pH的固绿分别染色，使细胞内酸性蛋白和碱性蛋白显示出来。
四．实验步骤
1．取材和涂片
乙醚麻醉或毁髓法处死蟾蜍，剪开胸腔，打开心包，小心在心脏上剪一小口，立即将心脏血滴于干净载玻片的一端，用另一载玻片的一端边缘紧贴在血滴处使血液沿其边缘展开后，以45度角向另一端推去，形成较薄的血膜，室温下晾干。
2．固定
将晾干的血涂片作好标记，于95%乙醇中浸泡5分钟，室温晾干。
3．三氯醋酸处理
将已固定的血图片浸在90度的三氯醋酸溶液中处理20分钟，清水反复冲洗玻片上的三氯醋酸直至冲尽。
4．染色
取两张三氯醋酸处理过的血涂片分别放入0.1%酸性固绿和0.1%碱性固绿中，分别染色5分钟和15分钟，水冲、晾干、镜检。
五．结果观察
显微镜下可见经酸性固绿染色的片因胞质和核仁中有酸性蛋白分布而被染成绿色，细胞核未着色；经碱性固绿染色的片只有细胞核被染成绿色，这是碱性蛋白分布的部位。
附：试剂配制
1．5%三氯醋酸液
三氯醋酸5.0g
蒸馏水100ml
2．0.1%酸性固绿染液（PH2.2）
(1) 0.2%固绿水溶液
固绿 0.2g
蒸馏水 100ml
(2) mol/L´75盐溶液
盐酸（比重1.19）0.109ml（若比重为1.16则为0.13ml）
蒸馏水至100ml
使用时将以上两种溶液以1：1混合即可。
3．0.1%碱性固绿染液
(1)固绿 0.2g
蒸馏水 100ml
(1) 碳酸钠（Na2CO3） 50mg
蒸馏水 100ml
使用时将以上两种溶液以1：1混合即可。
细胞内DNA和RNA的显示
一．实验目的
1．了解DNA和RNA呈色反应的一般原理和方法
2．掌握DNA和RNA在细胞内的分布情况
二．器材、试剂及材料
1．器材
显微镜、解剖盘、解剖镊、解剖剪、染色盘架、染色缸、载玻片、吸管、吸水纸
2．试剂
95%乙醇、甲基绿—派洛宁混合液
3．材料
蟾蜍
三． 实验原理
细胞经甲基绿—派洛宁混合液染色后，胞内的DNA和RNA发生不同的颜色反应，两种染液混染时，两种染色剂与两种聚合程度不同的核酸竞争性结合，DNA（为高聚分子）被甲基绿染成绿色；RNA（为低聚分子）被派洛宁染成红色。这样就使细胞中两种核酸分布显示出来。
四． 实验步骤
1．取材和固定
取蟾蜍血，制成血涂片，95%乙醇固定10分钟，室温晾干。
2．染色
将固定后的血涂片放在染色盘架上，加数滴甲基绿—派洛宁混合液，染色5—10分钟。
3．冲洗
用蒸馏水冲去染液后以吸水纸吸干载玻片上多余水分，注意不可使血膜处吸得过干。
五． 结果观察
显微镜下仔细观察红细胞的核质和胞质的颜色。
附：试剂配制
甲基绿-派洛宁染液
3． 0.2mol /L醋酸缓冲液(pH 4.8)
4． (1)冰醋酸 1.2ml
5． 蒸馏水至 100ml
6． (2)醋酸钠(NaAc.3H2O) 2.7g
7． 蒸馏水 100ml蒸馏水
8． 使用时两液按2:3比例混合。
兔红细胞膜通透性的实验观察
一、实验目的
了解细胞膜的通透性变化。
二、器材、试剂及材料
1．器材
显微镜、试管架、小试管、2ml注射器、手术刀、手术剪、小镊子、载玻片、盖玻片、移液管、吸管、橡皮吸球、吸水纸、记号笔
2．试剂
生理盐水、0.17mol/L氯化铵、0.17 mol/L氯化钠、0.17 mol/L草酸胺、0.32 mol/L葡萄糖、0.32 mol/L甘油、0.32 mol/L乙醇、500u/ml肝素
3．材料
小白鼠、10%兔RBC或羊RBC悬液悬液。
三、实验原理
细胞膜是细胞与外界环境进行物质交换的结构，它可选择性地让某些物质进出细胞，对于不同性质的物质，细胞膜的通透性是不一样的（有的溶质分子可以透入，有的溶质分子不能透入，即使能透入，速度也有差异）。对于水分子来说，是以易化扩散的方式通过细胞膜的，当细胞与其存在的环境存在渗透压差别时，水分子可从渗透压低的一侧向渗透压高的一侧扩散，以至于在高渗环境中，动物细胞会失水而皱缩；在低渗环境中，动物细胞会吸水膨胀直至破裂。
本实验将红细胞分别放于各种等渗溶液中，由于红细胞膜对不同溶质的通透性不同，使得不同溶质透入细胞的速度相差很大，有些溶质甚至不能透入细胞。当溶质分子进入红细胞后可引起渗透压升高，水分子随即进入细胞，使细胞膨胀，膨胀到达一定程度时，红细胞膜会发生破裂，血红素逸出，此时，原来不透明的红细胞悬液突然变成红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为红细胞溶血。
由于各种溶质进入细胞的速度不同，故不同的溶质诱导红细胞溶血的时间也不相同，反过来可通过测量溶血时间来估计细胞膜对各种物质通透性的大小。
四、结果观察
1．观察10%的兔红细胞悬液，可见该悬液为一种不透明的红色液体。
2．观察溶血现象：取一支试管，加入0.5ml兔红细胞悬液，再加入5ml蒸馏水，混匀后注意观察溶液颜色的变化，可见溶液由不透明的红色变成透明的红色液体（可将试管贴靠在书上，隔着试管看书中的字，如发生溶血则文字可被看清）。
3．观察兔红细胞对不同物质的通透性。
(1)取试管一支，分别加入0.5ml兔红细胞悬液和5ml0.17mol/L的氯化铵溶液，轻轻摇匀，用上述方法观察是否出现溶血现象，如出现溶血，记下发生溶血所需的时间（从加入5ml溶液算起）。
(2)另取试管一支，分别加入0.5ml兔红细胞悬液和5ml 0.17mol/L氯化钠溶液，摇匀后观察是否发生溶血。
(3)按上述方法分别观察下列6种等渗溶液是否可至红细胞溶血，并记录实验结果。
0.32mol/L葡萄糖 0.17mol/L硝酸钠
0.32mol/L甘油 0.17mol/L硫酸钠
0.32mol/L乙醇 0.17mol/L草酸胺
五、作业
1、列表小结红细胞膜对8种物质通透性的实验结果。列表项目；编
号、溶液种类、是否溶血、溶血时间。
附：试剂配制
1．0.17mol/L氯化铵溶液
氯化铵 4.574g
蒸馏水 500ml
2．0.17mol/L氯化钠溶液
氯化钠 4.967g
蒸馏水 500ml
3．0.17mol/L硝酸钠溶液
硝酸钠 7.224g
蒸馏水 500ml
4．0.17mol/L硫酸钠溶液
硫酸钠（Na2SO4·10H2O） 19.333g
蒸馏水 500ml
5．0.17 mol/L草酸胺溶液
草酸胺（NH4）2C2O4·H2O 8.527g
蒸馏水 500ml
6．0.32 mol/L葡萄糖溶液
葡萄糖 28.83g
蒸馏水 500ml
7．0.32 mol/L甘油溶液
甘油C3H5（OH）31.26g/ml 11.7ml
蒸馏水 500ml
8．0.32 mol/L乙醇溶液
无水乙醇 9.33ml
蒸馏水 500ml
9．10%兔红细胞悬液
兔血（加肝素抗凝） 10ml
生理盐水 90ml
小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬活动的观察
一、实验目的
了解细胞的吞噬运动。
二、器材、试剂及材料
1．器材
显微镜、试管架、小试管、2ml注射器、手术刀、手术剪、小镊子、
载玻片、盖玻片、移液管、吸管、橡皮吸球、吸水纸、记号笔
2．试剂
6%淀粉肉汤（含台盼蓝）、生理盐水、1%鸡RBC悬液
3．材料
小白鼠
三、实验原理
高等动物体内存在着具有防御功能的吞噬细胞系统，它由粒细胞系和
单核细胞等白细胞构成，是机体免疫系统的重要组成部分。在白细胞中，以单核细胞和粒细胞的吞噬活动较强，故它们常被称为吞噬细胞，当单核细胞在骨髓中形成后会进入血液，通过毛细血管进入肝、脾、淋巴结及结缔组织中进一步发育，分化为巨噬细胞。巨噬细胞是机体内的一种重要的免疫细胞，具有非特异性的吞噬功能，当机体受到细菌等病原体和其它异物入侵时，巨噬细胞将向病原体或异物游走（趋化性），当接触到病原体或异物时，伸出伪足将其包围并进行内吞作用，将病原体或异物吞入细胞，形成吞噬泡，进而初级溶酶体与吞噬泡发生融合，将异物消化分解掉。
四、实验步骤
1．巨噬细胞的诱生
在实验前三天，每天向小白鼠腹腔注射6%的淀粉肉汤1ml（含0.4%
台酚蓝），以刺激小白鼠的腹腔产生较多的巨噬细胞（该步骤由教师完成）。
2．鸡RBC注射
每组取一只经上述处理的小白鼠，腹腔注射1%鸡RBC悬液0.5 ~
1ml，然后轻揉小鼠腹部，使鸡红细胞分散。
3．处死
30分钟后，用颈椎脱臼法处死小鼠，迅速剖开腹腔。
4．取材
往腹腔中注入0.5ml生理盐水，用牙签轻轻将腹腔液和生理盐水混
合均匀。用未装针头的注射器抽取腹腔液进行滴片，然后盖上盖玻片，每人制片一张。
五、结果观察
取制备好的临时标本片置于光镜下，将光线调至稍暗，先用低倍镜找
到标本，再转成高倍镜仔细观察。在标本中可以见到许多含蓝色颗粒的圆形或不规则的细胞，这便是巨噬细胞，蓝色颗粒是巨噬细胞吞噬含酚蓝的淀粉肉汤后形成的吞噬泡（台酚蓝在此起标记巨噬细胞的作用）。还可见少量淡黄色椭圆型有核的鸡红细胞，慢慢移动玻片标本，仔细观察巨噬细胞吞噬鸡红细胞的过程：有的鸡红细胞（1个至多个）紧帖于巨噬细胞表面；有的巨噬细胞已将一个至数个鸡红细胞部分吞入；有的巨噬细胞已吞入一个或几个红细胞，形成椭圆形吞噬泡；有的巨噬细胞内的吞噬泡已与溶酶体融合，正在被消化，体积缩小呈圆形。
附：试剂配制
1．含台酚蓝的6%淀粉肉汤
牛肉 0.3g
蛋白胨 1.0g
氯化钠 0.5g
台盼蓝 0.3g
蒸馏水 100ml
可溶性淀粉 6.0g
将上述各成分混匀,煮沸灭菌,置4°C冰箱中保存备用,用时水浴融化。
2．500u/ml肝素
取肝素注射液1支（12500u），用注射器抽取2ml肝素加入到23ml
生理盐水中混匀，4°C保存。
3．1%鸡红细胞悬液
鸡血（加肝素抗凝） 1ml
生理盐水 99ml
洋葱根尖细胞有丝分裂的观察
一、实验目的
1．了解植物细胞有丝分裂的基本过程及分裂各期的形态特征。
2．初步掌握绘图方法。
二、器材及材料
1．器材
显微镜、拭镜纸、二甲苯。
2．材料
洋葱根尖纵切片标本。
三、实验观察
1．取洋葱根尖纵切片标本，在低倍镜下找到洋葱根尖，洋葱根尖最
前端细胞排列不规则，呈帽状为根冠，紧接着的部位是生长点，细胞体积较小，排列紧密，近似正方形。该处是根的生长中心，细胞具有旺盛的分裂能力，紧挨生长点的细胞伸长，细胞核相对较小，称延长区。表面细胞有向外伸出的纤细的根毛，这个区域称根毛区。
2．在低倍镜下找到生长点，这里有许多处于不同发育时期的细胞。选择分裂细胞较多的部位，转换高倍镜，观察处于有丝分裂不同时期的细胞。
(1)间期：细胞壁、细胞质和细胞核均清晰易辨。细胞核呈圆球形、染色质分布均匀，可见1~2个染色较深的核仁。
(2)有丝分裂期
前期：核膨大，核内染色质浓缩，形成染色体，核膜破裂，核仁消失。
中期：细胞内的全部染色体移向细胞中央，并排列在赤道面上，形成赤道板。在赤道板的两极方向有许多丝状结构，形成纺锤体。此时的染色体已纵裂成两条染色单体，中间借着丝粒相连。
后期：纵裂后的染色单体相互分离，全部染色体分成数目相等的两组，在纺锤丝的牵引下，分别向细胞两极移动。
末期：到达两极的染色体又逐渐伸长变细，成为染色丝。晚末期细胞，染色丝逐渐恢复成染色质，核膜形成，核仁也开始出现，纺锤体消失。细胞中央的微管形成成膜体，再由它融合成细胞板，进而形成细胞壁，最后形成两个子细胞。
马蛔虫受精卵细胞有丝分裂的观察
一、实验目的
1．了解动物细胞有丝分裂的基本过程及分裂各期的形态特征。
2．进一步掌握绘图方法。
二、器材及材料
1.器材
显微镜、拭镜纸、二甲苯。
2．材料
马蛔虫子宫横切片标本。
三、实验观察
1．取马蛔虫子宫横切片标本，置低倍镜下观察，可见子宫腔内有许
多圆形的、处于不同分裂时期的受精卵细胞。每一个受精卵外围有一层较厚的卵壳，它与受精卵细胞之间的腔隙称围卵腔。由于制片过程中固定、脱水等原因，使细胞质收缩，因此围卵腔较空旷。在有些受精卵细胞表面和受精卵壳内表面可见极体附着。极体呈黑色，近圆形或半圆形。
2．换用高倍镜，观察分裂各期细胞：
前期：细胞核膨大，染色质逐渐浓集成染色丝，进而缩短变粗形成染色体，核仁、核膜消失。中心体的两个中心粒彼此分开，各自向细胞两极移动，每一个中心粒周围出现放射状排列的细丝，为星体纤维。
中期：染色体排列在细胞赤道面上，形成赤道板。但由于切面不同，可以看到两种不同的图像。从极面观，可见染色体排列如菊花状，有的细胞可以清楚地观察到马蛔虫受精卵细胞的6条染色体；从侧面观，染色体呈分岔横线状，排列在细胞中央，两极各有一个中心粒，其周围有星射线，中心粒之间有纺锤丝与染色体着丝粒相连。
后期：染色体着丝粒分离，姊妹染色单体彼此分开，分别向细胞两极移动；细胞拉长，中部的细胞膜开始内陷，出现横缢。
末期：两极的染色体逐渐解旋，伸长形成染色丝。晚末期，染色丝变成染色质；核仁、核膜重新出现，形成新核；纺锤丝、星射线消失。细胞膜的内陷逐渐加深，最后细胞完全分离，形成两个子细胞。
四．作业
1．绘洋葱根尖细胞有丝分裂图。
2．比较动、植物细胞有丝分裂过程的异同。
动物细胞减数分裂标本的制备与观察
一、 实验目的
1．掌握动物细胞减数分裂的基本过程。
2．熟悉动物细胞减数分裂标本的制备方法。
二、实验原理
减数分裂普遍存在于有性生殖动、植物的生殖细胞，是遗传物质在
亲代与子代之间进行重新分配的主要机制。减数分裂是一种特殊形式的有丝分裂，包括两次连续的分裂过程，由于染色体在分裂之前只复制一次，故经减数分裂后所形成的配子的染色体数目将减少到原来的一半。
生殖细胞对物理(电离辐射)、化学(化学诱变剂)和生物(某些病毒)等诱变因素的作用十分敏感。当前环境中各种诱变因素不断增加，对人类产生的有害遗传效应日趋严重。检查减数分裂染色体可以直接观察生殖细胞中遗传物质(染色体)的受损情况。
三、器材、试剂与材料
1．器材
光学显微镜、水浴箱、离心机、刻度离心管、吸管、试管架、天平、
剪刀、镊子、研磨器、刀片、烧杯、注射器、酒精灯、载玻片、盖玻片
2．试剂
0.1%秋水仙素、2%枸橼酸钠、0.075% KCl、甲醇、冰醋酸、Giemsa
染液
3．材料
小鼠睾丸
四、实验步骤
1．注射秋水仙素
实验前2 h给雄性小鼠腹腔注射秋水仙素(2mg/g体重)。
2．处死
用颈椎脱臼法处死小白鼠
3．取材
立即取出一侧睾丸，置入2%枸橼酸钠溶液，洗去血液，移入盛有10 ml上述溶液的小烧杯内，剪开白膜，取出曲细精管，除去脂肪和结缔组织，将曲细精管和溶液移入研钵。
4．制备细胞悬液
用剪刀将曲细精管剪成1mm左右的短管，随即研磨5-10min，制成睾丸组织细胞悬液。
5．离心
将上述悬液移入离心管，200-300rpm离心3-4min。
6．低渗处理
吸取中层细胞悬液2-4ml，移入另一离心管，加等量0.075% KCl，置37°C水浴中低渗处理20 min。
7．离心
800 rpm离心5min，弃上清，得细胞沉淀。
8．固定
加入新鲜配制的3:1甲醇-冰醋酸固定液3-4 ml，5min后用吸管将细胞团块轻轻翻转，再过15-20min，用吸管将细胞团块轻轻打散。
9．离心
800 rpm离心5min，弃上清液。
10．制备细胞悬液
另加入新鲜配制的固定液少许，用吸管打匀成较浓的细胞悬液。
11．制片
按常规染色体标本制片法制片：从冰水中取一干净载波片，滴3-4滴细胞悬液，立即轻轻吹气，使细胞迅速分散，在酒精灯上微热烤干。
12．染色
用Giemsa染液染色10min，自来水冲洗3-5次，凉干。
五、结果观察（略）
附：试剂配制
1．秋水仙素(100μg/ml)
秋水仙素 10.0mg
灭菌生理盐水 l00ml
2．0.075mol/L氯化钾低渗液
氯化钾 0.559g
蒸馏水 100ml
3．甲醇冰醋酸(3:1)固定液
甲醇 3份
冰醋酸 1份
临用时配制。
4．1/15mol/L磷酸缓冲液(pH6.8)
A液：磷酸氢二钠 9.078g,溶于1000ml蒸馏水。
B液：磷酸二氢钾 11.867g,溶于1000ml蒸馏水。
A液50.8ml加B液49.2ml即成。
5．姬姆萨染液
姬姆萨染料 1.0g
甘油 66ml
甲醇 86ml
先将姬姆萨染料粉末置于研钵中加少量甘油,充分研磨,呈无颗粒的糊状，再将全部甘油加入,放入50℃温箱中2小时。边研磨边加入甲醇，保存于棕色瓶内,2周后过滤即成原液。
取上述制成的姬姆萨染液1ml加1/15mol/L磷酸缓冲液(pH6.8)10ml混合即成备用液。
人类染色体标本的制备和分析
一、实验目的
1．掌握外周血淋巴细胞短期培养的技术方法
2．掌握染色体标本制作技术
3．学会人体染色体核型分析
二、器材、试剂及材料
1．器材
恒温培养箱、恒温水、离心机、刻度离心管，链霉素瓶、注射器、注射针头、滴管。
2．试剂
RPMI1640培养液，秋水仙素、低渗液、固定液、Giemsa染液、PHA、肝素、小牛血清。
3．材料
人外周血
三、实验原理
外周血淋巴细跑在植物凝血素(PHA)刺激下转化为淋巴母细胞并进行分裂，经过72小时培养可获足量处于分裂中的淋巴细胞。培养到69小时，加入秋水仙素使分裂中的细胞停止于分裂中期。此时的染色体形态最典型，便于观察和计数。
四、实验步骤
1．细胞培养
按无菌操作技术配制培养基每瓶5ml，以无菌技术抽取外周血2ml(肝素抗凝，每2ml血含肝素0.3ml)，接种在4~6瓶培养基中，每瓶加血0.3ml(约8号针头12滴)，将血及培养基摇动混匀，放在37℃恒温箱内培养。
2．秋水仙素处理
收获前3小时，每瓶加入秋水素，使其终浓度为0.2ug/ml，混匀后继续培养2~3小时。
3．收获细胞
培养至72小时，将培养瓶取出，培养物吸入离心管内，离心（1200rpm）10分钟。
5．低渗处理
弃上清，每管内加入37C预热的低渗液5ml，37C水浴低渗处理15分钟。
5．预固定
每管加入固定液lml，轻轻吸冲混匀，预固定2分钟，离心（1200rpm）10分钟。
6．第一次固定
弃上清，加入新鲜固定液5ml，轻轻吸冲混匀，固定30分钟以上，离心（1200rpm）10分钟。
7．第二次固定
重复步骤6，固定20分钟。
8．制片
弃上清，加入4滴新鲜固定液，轻轻吸冲混匀，用滴管滴在干净玻片上，空气干燥。
9．染色
Giemsa染色15分钟，自来水冲洗，自然干燥。
五、结果观察
将制好的染色体标本，先在低倍镜下观察，可见到许多大小不等被染成紫红色的呈圆形的间期细胞核，其间分散着中期分裂相，通常由一团极其细小的紫黑色小点组成，每一个小点即为一条染色体。选染色体形态清晰、分散好的分裂相，移至视野的中央转换高倍镜、油镜进行观察分析，并摄像、冲印照片，进行核型排列。
人类中期染色体由两条相同的染色单体借着丝粒相连而成。着丝粒将染色体分成长臂和短臂。正常人体细胞的染色体数目为46条，按形态特征可配成23对，1~22对为常染色体，另一对为性染色体，在女性为XX，在男性为XY。将二个细胞中的全套染色体按一定方式(Denver体制)排列起来，就是核型(karyotype)。
按Denver体制，人类体细胞的46条染色体，根据其大小，着丝粒位置的不同，可分成7个组。
A组：包括第1~3对三对染色体，容易区分。
第1对：最大，中央着丝粒，长臂近侧有副缢痕。
第2对：较大，着丝粒略偏离中央。
第3对：较大，中央着丝粒。
B组：包括第4、5对二对染色体，较大，亚中央着丝粒，不易区分。
C组：包括第6~12对七对染色体，X染色体也列入此组。此组染色体中等大小，都有亚中央着丝粒，彼此间难于区分。第6~8，11四对染色体的着丝粒略近中央，第9、10、12三对染色体的着丝粒偏离中央。X染色体的大小介于第7对和第8对之间。
D组：包括第13~15对三对染色体，中等大小，近端着丝粒，有随体，彼此间不易区分。
E组：包括第16~18对三对染色体。
第16对：中等大小，中央着丝粒同长臂上有副缢痕。
第17对：中等大小，亚中央着丝粒。
第18对：中等大小，亚中央着丝粒。但短臂比11号短。
F组：包括19~20对二对染色体，体积小，有中央着丝粒，彼此间不易区分。
G组：包括第21、22对二对染色体，Y染色体也列入此组。第21、22对体积小，近端着丝粒，有随体，长臂常呈分叉状，彼此间不易区分。Y染色体略大，长臂常常平行相并，短臂末端无随体。
附：试剂配制
1．秋水仙素（100μg/ml）
秋水仙素 10.0mg
灭菌生理盐水 100ml
2．氯化钾低渗液（0.075mol/L）
氯化钾(KCl) 559mg
蒸馏水 100ml
3．甲醇冰醋酸固定液（3：1）
甲醇 3份
冰醋酸（冰乙酸） 1份
临时配制。
4．Giemsa染液
Giemsa染料 1g
甘油 66ml
甲醇 6ml
磷酸缓冲液（pH7.4） 9ml
动物染色体标本的制备与观察
一、实验目的
掌握动物骨髓细胞染色体标本制备的基本过程及其基本原理。
二、器材、试剂及材料
1．器材
离心机、显微镜、粗天平、染色盘架、育刀、链子、注射器、离心营、吸营、试管架、冰载足片、酒精灯、妙布、记号笔。
2．试剂
秋水仙素(100μg/ml)、低渗液(0.075mol/L KCl)、甲醇冰醋酸(3:1)固定液、姬姆萨(Giemsa)染液、l/15mol/L磷酸缓冲液(pH6.8)。
3．材料
小白鼠(体重18~25克)
三、实验原理
染色体只有在分裂期的细胞,特别是中期细胞中表现出典型形态，才便于观察和计数，所以必须采用特殊的技术方法，从发生有丝分裂的组织和组胞悬液中得到。最常用的途径是从骨髓细胞、血淋巴细跑和组织培养的细胞中制备。骨髓细胞数量多，分裂旺盛，不需体外培养和无菌操作,便于取材。
四、实验步骤
1．注射秋水仙素
实验前3~4小时，给小白鼠腹腔注射秋水仙素(2μg/1g体重)。由于秋水仙素能抑制纺锤体的形成，从而使有丝分裂停止于中期。
2．取股骨
用颈椎脱臼法处死小白鼠,在盘中用剪刀剪开小白鼠后肢大腿上的皮肤和肌肉，暴露出股骨及其两端相连的关节，然后从两端关节头处分离下股骨，用纱布擦净骨上残余的肌肉和血液。
3．收集细胞和低渗处理
先在离心管中加入8ml0.075mol/L KCl低渗溶液,然后在股骨两端，剪去少量骨质使骨髓腔暴露(注意不能剪掉太多，以防骨髓细胞过多丢失)。用镊子夹住股骨中部，用注射器抽取离心管中的低渗溶液，将针头从股骨一端插入骨髓腔，冲洗腔内骨髓于离心管中,反复冲洗直至骨髓腔变白为止,在室温下静止30分钟左右。经低渗处理可使细胞膨胀,促使中期染色体散开。
4．固定和离心
在终止低渗处理前1~2分钟,加入固定液0.1ml,用吸管轻轻吸液冲打混匀，进行预固定。将离心管作好标记,并将放于离心机对称位置的两支离心管，在天平上配平重量,以800转/分离心8分钟,用吸管小心吸去上清液,沿管壁加入固定液5ml，并用吸管将沉淀物轻轻冲打，使细胞悬浮均匀。静置15~20分钟,再重复离心二次。
5．制备骨髓细胞悬液
吸去上清液,在留有细胞的离心管中加入0.3-0.5ml固定液,用吸管轻轻冲打制成细胞悬液。注意冲打时不要把悬液吸到吸管上部的宽大部分,以免细胞粘于管壁上而丢失。
6．滴片
取一张冰载玻片,吸取细胞悬液,在离载玻片20~30厘米的高度，滴2~3滴于冰载玻片上，轻吹片上的液滴,立即在酒精灯火焰上微烤,以便染色体铺展和分散,将制片倾斜放置晾干。
7．染色
将标本片平放于染色盘架上，用姬姆萨染液(pH6.8磷酸缓冲液1:10稀释)染色10分钟左右,用水冲去多余染液，晾干待镜。
五、结果观察
将制好的染色体玻片标本，先在低倍镜下作全面观察,可见到许多大小不等被染成紫红的呈圆形的间期细胞核，仔细寻找分散在它们之间的中期分裂相,选取染色体形态良好，分散适中的分裂相，移至视野中央，转换高倍镜(或油镜)进行观察分析。小白鼠染色体一般呈“U”形，均为近端着丝粒染色体,染色体2n=40，其19对为常染色体，一对为性染色体，X染色体的大小介于2、3号染色体之间，Y染色体最小，可参照小白鼠染色体照片加以观察。
附：试剂配制
1．秋水仙素（100μg/ml）
秋水仙素 10.0mg
灭菌生理盐水 100ml
2．氯化钾低渗液（0.075mol/L）
氯化钾(KCl) 559mg
蒸馏水 100ml
3．甲醇冰醋酸固定液（3：1）
甲醇 3份
冰醋酸（冰乙酸） 1份
临时配制。
4．Giemsa染液
Giemsa染料 1g
甘油 66ml
甲醇 6ml
磷酸缓冲液（pH7.4） 9ml
细胞融合
一、 实验目的
1．掌握细胞融合的概念、融合细胞的识别及细胞融合率的计算。
2．初步掌握聚乙二醇（PEG）诱导细胞融合的方法。
3．了解细胞融合的基本原理及应用领域。
二、实验原理
细胞融合（cell fusion）是指两个或两个以上的细胞合并形成一个
细胞的过程。同种细胞融合形成的双核或多核细胞称为同核体，异种细胞融合形成的双核或多核细胞称为异核体。
在通常情况下，由于细胞膜的完整性，相互接触的细胞并不发生融合现象。但在某些生理情况下，相互接触的细胞可以发生细胞融合，也可用人工方法（物理、化学、生物）诱导细胞融合。
在细胞融合诱导物（灭活的仙台病毒、PEG、电脉冲）的作用下，细胞膜结构发生变化，促使细胞发生聚集，相互接触的细胞膜之间融合，继之细胞质融合，形成一个双核或多核的融合细胞。
PEG诱导细胞融合既简便、易行，且效果稳定，是目前应用最广泛的方法。
细胞融合主要应用于细胞工程学、遗传学、免疫学和肿瘤学等研究领域。
三、器材、试剂与材料
1．器材
光学显微镜、离心机、水浴箱、刻度离心管、吸管、试管架、天平、
酒精灯、载玻片、盖玻片。
2．试剂
Alsver液、0.85% NaCl、Hanks液、50% PEG、0.2%次甲基蓝染液。
3．材料
鸡红细胞储备液或10%鸡红细胞悬液。
四、实验步骤
1．鸡红细胞储备液的制备
按鸡血1份，Alsver液4份的比例制备鸡红细胞储备液，存放于4°C
冰箱备用（1周内使用）。
2．10%鸡红细胞悬液的制备
取鸡红细胞储备液加入0.85% NaCl，1200rpm离心10 min，弃上清，
吸取鸡红细胞沉淀1ml，加入0.85% NaCl 10ml制成10%鸡红细胞悬液。
3．鸡红细胞的洗涤与沉淀
吸取10%鸡红细胞悬液1ml放入离心管中，加入Hanks液5ml混
匀，1000rpm离心5min。弃上清，用手指轻弹离心管底部，使沉淀的红细胞团块松散。
4．PEG诱导细胞融合
吸取37°C预热的50%PEG溶液0.5ml，在1min内逐滴加入装有红
细胞的离心管中，边加边轻轻摇动离心管，使PEG与细胞混匀，然后静置1min。上述过程在37°C水浴中进行。
5．终止PEG作用
缓慢加入Hanks液9ml，轻轻吹打混匀，于37°C水浴中静置5min。
6．收集细胞
1000rpm离心5min，弃上清。
7．滴片、染色
吸取细胞悬液，滴片，自然干燥，0.2%次甲基蓝染液染色10min。
8．镜检、计数
五、结果观察
显微镜下观察细胞融合的情况，通常将融合过程分为5个阶段。
1．两个细胞的细胞膜相互接触、粘连。
2．接触部位的细胞膜破溃。
3．两细胞之间的细胞质相通，形成细胞质通道。
4．通道扩大，两细胞连成一片。
5．细胞融合完成，形成一个含有两个或多个核的圆形细胞。
六、融合率的计算
融合的细胞核数
融合率= ´100%
总细胞核数
附：试剂配制
1．Alsver液
葡萄糖 2.05g
柠檬酸(C6H5O7.H2O) 0.55g
柠檬酸钠(Na3C6H5O7.5H2O) 0.8g
NaCl 0.42g
蒸馏水至 100ml
2．Hanks液(pH7.4)
(1)原液甲
NACl 160g
KCl 8g
MgSO4.7H2O 2g
MgCl2.6H2O 2g
溶于800ml蒸馏水，混匀后，加入CaCl2(无水)2.8g，再加入蒸馏水至1000ml。滤纸过滤，加入氯仿2ml，存放于4°C冰箱备用。
(2)原液乙
Na2HPO4.12H2O 3.04g
KH2PO4 1.2g
葡萄糖 20g
溶于800ml蒸馏水，混匀后，滤纸过滤。加入0.5%酚红80ml，再加入蒸馏水至1000ml，最后加入氯仿2ml，存放于4°C冰箱备用。
(3)工作液
甲乙液各一份，蒸馏水18份，混匀后高压灭菌，存放于4°C冰箱备用(可用1个月)。使用前用5.6%NaHCO3调pH至7.4。
3．0.5%酚红指示剂
将0.5g酚红置于研钵中，缓慢加入0.1N NaOH 15ml，边加边磨，直至全部溶解，然后加入85ml蒸馏水，滤纸过滤，室温保存备用。
4．50% PEG溶液(临用前配制)
PEG(MW1000)5g置试管中，在酒精灯上熔化。然后加入预热(37°C)的Hanks液10 ml混匀。pH6.0时细胞融合率最高。
5．0.2%次甲基蓝染液
次甲基蓝 0.2g
蒸馏水 100ml
